分子互作實驗：CUT&TAG靶向切割與標簽化

一、技術簡介

CUT&TAG是一種基于抗體引導的靶向染色質切割與標簽化的高靈敏度表觀基因組分析技術，該技術克服了傳統ChIP-seq的 低靈敏度、高背景噪音、樣本需求量大等瓶頸，可在單細胞水平解析組蛋白修飾、轉錄因子結合等染色質特征，成為表觀遺傳學研究的新方向。

二、技術原理

CUT&TAG通過 四步關鍵反應 實現精準染色質分析：

1. 抗體靶向定位：特異性一抗（如H3K4me3抗體）結合目標染色質區域，Protein A/G二抗攜帶Tn5轉座酶復合物（含測序接頭）。

2. 靶向切割與標簽化：Tn5轉座酶在抗體指引下，對目標染色質進行 DNA雙鏈切割與接頭連接，切割范圍：目標位點兩側各約50-300 bp。

3. DNA片段釋放：蛋白酶K消化染色質交聯，釋放帶接頭的DNA片段。

4. 文庫構建與測序：PCR擴增目標片段，構建Illumina測序文庫，測序深度：~20 million reads/sample（比ChIP-seq減少50%）。

三、應用場景

CUT&TAG在單細胞水平揭示腫瘤微環境中不同亞群的表觀遺傳差異。

例如：

1.三陰性乳腺癌：通過單細胞CUT&TAG發現FOXA1調控的超級增強子在基底樣亞型中特異性激活，這些增強子驅動了EMT（上皮-間質轉化）關鍵基因（如SNAI1）表達，促進轉移。

2.急性髓系白血病：追蹤復發患者骨髓樣本，鑒定出CD34+干細胞中H3K4me1修飾的動態變化，這些變化預示化療耐藥性的產生，為表觀靶向治療提供新靶點。

3.胚胎發育表觀重編程：CUT&TAG可追蹤早期胚胎發育中組蛋白修飾的動態建立過程。

4.小鼠著床前胚胎：發現H3K9me3在2-cell階段開始沉積，優先標記逆轉錄轉座子區域（如LINE-1），這種修飾通過抑制轉座子活性維持基因組穩定性。

5.人類胚胎干細胞：繪制H3K27ac在神經分化中的動態圖譜，定位SOX2和OCT4調控的增強子網絡，揭示多能性退出關鍵節點。

6.免疫細胞功能調控：解析T細胞分化與功能狀態的表觀基礎。

7.T細胞耗竭：在慢性病毒感染模型中，發現耗竭性CD8+ T細胞的H3K27ac在PD-1和TIM-3基因座異常富集，這些增強子活性受TOX轉錄因子直接調控。

8.調節性T細胞（Treg）：聯合ATAC-seq揭示FOXP3通過重塑H3K4me3修飾，穩定Treg細胞的抑制性功能，該過程依賴EZH2介導的H3K27me3協同抑制。

四、技術優勢

1.較高靈敏度（100細胞級檢測）：Tn5轉座酶直接在目標位點切割并連接測序接頭，避免ChIP-seq中DNA片段化（超聲破碎）造成的隨機損失。與ChIP-seq相比，CUT&TAG的信噪比提升8倍（S/N=12:1 vs 1.5:1），檢測到的差異峰數量增加40%。

2.單堿基分辨率與精準定位：抗體-Tn5復合物僅切割結合位點附近DNA（±50 bp），而ChIP-seq的超聲破碎產生200-500 bp隨機片段。在p53結合位點分析中，CUT&TAG檢測到單個狹窄峰（峰寬≈30 bp），而ChIP-seq呈現寬峰（峰寬≈200 bp），前者可精確定位到TTGCCT基序中心。

3.單細胞與空間表觀組學兼容性：聯合10x Genomics平臺，通過微流控將單個細胞與抗體-Tn5復合物包裹在油滴中，已實現單細胞H3K27ac圖譜構建（Nature Methods, 2022）。

4.新開發的Spatial CUT&Tag技術可在組織切片上定位H3K4me3的亞結構分布，例如在小鼠腦切片中可視化海馬區神經元活性相關修飾。

五、樣本類型

新鮮細胞（貼壁細胞/懸浮細胞）、凍存細胞、凍存組織。

六、樣本需求

細胞樣本：約10,0000個（可以是24孔板的1孔，或以懸浮細胞形式存儲于離心管中）；

凍存組織：約10-20mg。

七、樣本準備&運輸

活細胞樣本：距離較近的可提供新鮮樣本，將培養在皿/離心管內的新鮮細胞樣本常溫快遞（最遲次日達）運輸，本市內可閃送或親自遞送；距離較遠的，可-80℃凍存細胞干冰運輸；

組織樣本：-80℃凍存干冰運輸。

八、需提供的試劑

ChIP級抗體（沒有時也可以選擇IF級抗體）

九、實驗周期

1-2周（不包含測序）

十、其他

后續檢測Rrealtime PCR/測序