細(xì)胞凋亡檢測(cè)基于形態(tài)學(xué)的方法要怎么操作？

　　凋亡或者說(shuō)程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞內(nèi)建的防御機(jī)制之一，在生物的正常發(fā)育及疾病抵御中起到重要的作用。凋亡過(guò)程與通路的異常，會(huì)導(dǎo)致多種疾病，包括腫瘤。目前至少有十?dāng)?shù)種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，從大框架上講，可以劃分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類(lèi)。那么細(xì)胞凋亡檢測(cè)基于形態(tài)學(xué)的方法是怎么操作的呢？

　　

　　1、電子顯微鏡檢查

　　

　　“凋亡”是一個(gè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)概念。因此，鑒定凋亡的金指標(biāo)，往往是基于形態(tài)學(xué)的。凋亡和另外一種主要的細(xì)胞死亡類(lèi)型“壞死”有著顯著的亞細(xì)胞形態(tài)差異。簡(jiǎn)而言之，在透射電鏡下，凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃聚，通常沿核膜分布；整體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，如細(xì)胞表面微絨毛狀突起消失，細(xì)胞間接觸消失，細(xì)胞質(zhì)濃聚，形成具有膜結(jié)構(gòu)的包裹著胞漿內(nèi)容物和核物質(zhì)的凋亡小體；相比壞死，凋亡細(xì)胞的核結(jié)構(gòu)直到晚期才會(huì)解體。

　　

　　盡管電鏡檢查是細(xì)胞凋亡檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，然而其缺點(diǎn)也很明顯：無(wú)法定量（電鏡一個(gè)視野僅能觀察一兩個(gè)細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣（固定、切片到拍照），同時(shí)，并非所有實(shí)驗(yàn)室都能接觸到電鏡。因此，對(duì)于不專(zhuān)門(mén)研究凋亡這種細(xì)胞現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，基本沒(méi)有人選擇電鏡來(lái)檢測(cè)凋亡了。好在目前的主流期刊，也是接受不含電鏡的凋亡數(shù)據(jù)。

　　

　　2、細(xì)胞核形態(tài)染色

　　

　　既然凋亡細(xì)胞其中一個(gè)形態(tài)學(xué)特征是染色質(zhì)濃聚，且細(xì)胞核結(jié)構(gòu)在凋亡后期崩解，那么觀察核形態(tài)也是較為直接的指標(biāo)。相比其他形態(tài)學(xué)指標(biāo)來(lái)說(shuō)，觀察細(xì)胞核形態(tài)不需要電子顯微鏡，而只需用熒光染料配合普通的熒光顯微鏡即可。

　　

　　一般而言，核形態(tài)染色采用的是DAPI和Hoechst系列熒光染料。因?yàn)檫@些染料特異性強(qiáng)，熒光性能好。其中，Hoechst33342是最為方便的染料。它可自由穿透細(xì)胞膜，直接對(duì)核染色，而不需要固定、破膜步驟。因此，Hoechst33342還能結(jié)合形態(tài)學(xué)的相差圖像，以及其他活細(xì)胞染料（如用7-AAD等染細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞），同時(shí)對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行定量。

　　

　　除了實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低廉之外，核形態(tài)染色的優(yōu)勢(shì)還在于它是一個(gè)定量指標(biāo)。因此，這也是我常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)指標(biāo)之一。不過(guò)，定量依賴(lài)于拍攝照片后對(duì)多個(gè)視野的不同核形態(tài)手動(dòng)計(jì)數(shù)。